Flüssig

Sep 26, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5035 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Nicht komprimierbare Blutungen sind eine ungelöste klinische Herausforderung, die für eine hohe Mortalität bei Traumata verantwortlich ist. Schnelle Blutströme unter Druck bei Blutungen beeinträchtigen die Funktion und Integrität von hämostatischen Wirkstoffen und die Haftung von bioadhäsiven Dichtungsmitteln. Hier berichten wir über das Design und die Leistung bioinspirierter mikrostrukturierter Bioadhäsive, die aus einem makroporösen, zähen Xerogel hergestellt werden, das mit funktionellen Flüssigkeiten angereichert ist. Das Xerogel kann Grenzflächenflüssigkeiten wie Vollblut schnell absorbieren und die Blutgerinnung fördern, während die infundierten Flüssigkeiten die Grenzflächenbindung, Versiegelung und antibakterielle Funktion erleichtern. Ihre Synergie ermöglicht es den Bioadhäsiven, eine starke Haftung auf ex vivo menschlichen und Schweinegeweben und verschiedenen technischen Oberflächen zu bilden, ohne dass eine Kompression erforderlich ist, sowie bei Bedarf eine sofortige Entfernung und Lagerstabilität. Wir zeigen eine deutlich verbesserte hämostatische Wirksamkeit und Biokompatibilität bei Ratten und Schweinen im Vergleich zu nichtstrukturierten Gegenstücken und kommerziellen Produkten. Diese Arbeit eröffnet neue Wege für die Entwicklung von Bioadhäsiven und hämostatischen Dichtungsmitteln.

Unkontrollierte Blutungen sind für mehr als 30 % der traumatischen Todesfälle verantwortlich1,2. Trotz enormer Forschungsanstrengungen bleiben entscheidende Herausforderungen bei der Behandlung von nicht komprimierbaren und tiefen, schmalen Blutungen, die einen schnellen Druckblutfluss aus Wundstellen verursachen3,4. Gängige Strategien, die sich zur Förderung der Blutgerinnung allein auf hämostatische Wirkstoffe wie Thrombin und Kaolin verlassen, werden durch eine langsame Gerinnungsrate und Koagulopathien eingeschränkt5. Alternative Strategien sind bioadhäsive Dichtungsmittel, die die Blutungsstelle physisch blockieren6,7,8,9,10. Die Entfernung von Grenzflächenflüssigkeiten ist entscheidend für die Adhäsionsbildung und die Versiegelungsleistung der Bioadhäsive11. Allerdings sind vorhandene Bioadhäsive aufgrund ihrer nicht- und nanoporösen Strukturen langsam und ineffektiv bei der Entfernung des schnell unter Druck stehenden Blutes an der Grenzfläche12,13. Situationen in Point-of-Care- und Notaufnahmen stellen andere Anforderungen wie Benutzerfreundlichkeit und Stabilität der Lagerung, die oft übersehen werden1. Um diese Herausforderungen anzugehen, sind neue Designs und Materialien für nicht komprimierbare Blutungen erforderlich.

In der Natur haften einige Meeresorganismen mit Klebstoffen, die eine mikrostrukturelle Architektur und eine infundierte Flüssigkeit aufweisen, an biologisch verschmutzten Oberflächen. Beispiele hierfür sind Muschelplaques mit mikroporöser Struktur14 und Plattwürmer mit Drüsenkanälen zur Speicherung und Abgabe von Klebeflüssigkeiten (Abb. 1a)15. Diese mikrostrukturierten Bioadhäsive stehen im Gegensatz zu klinisch verwendeten Bioadhäsiven wie Cyanacrylat, Fibrinklebern und Bioadhäsiven auf Hydrogelbasis, denen poröse Strukturen und infiltrierte Flüssigkeiten fehlen12,16. Klebstoffe auf Catecholbasis, die von Muscheln inspiriert sind, erzeugen eine mäßige Nasshaftung, ahmen aber auch nicht die porösen Strukturen nach14. Diese unstrukturierten/homogenen Designs könnten Leckagen vermeiden und die Abdichtung verbessern, schränken aber wiederum die Fähigkeit ein, die Grenzflächenflüssigkeit zu absorbieren und zu manipulieren. Eine solche Einschränkung ist unter Blutungsbedingungen nachteilig, da schnell unter Druck stehendes Blut hämostatische Wirkstoffe auswaschen und schlecht gebildete Blutgerinnsel zerstören kann, die von Natur aus spröde sind17,18,19. Obwohl Grenzflächenflüssigkeiten die Adhäsion von Materialien hemmen, können nichtstrukturierte Bioadhäsive diese Flüssigkeiten aufgrund des langsamen Diffusionsprozesses und der großen Blutbestandteile nicht schnell entfernen, selbst wenn eine trockene Matrix und/oder eine hydrophobe abstoßende Flüssigkeit verwendet wird8,20. Die Absorption und Widerstandsfähigkeit von unter Druck stehenden Blutströmen ist daher für hämostatische Technologien bei der Behandlung nicht komprimierbarer Blutungen von entscheidender Bedeutung.

a Schematische Darstellung von Meeresorganismen, die miteinander verbundene Mikroporen zur Haftung und zum Transport flüssiger Reagenzien enthalten. b Schematische Darstellung der Anhaftung von LIMB an blutexponierten Substraten. c Schematische Darstellung, die zeigt, dass LIMB Grenzflächenflüssigkeit aufnehmen, funktionelle Flüssigkeiten absondern und Blut koagulieren kann, wodurch eine Adhäsions-, hämostatische und abdichtende Funktion gewährleistet wird. d Konfokales Bild von Rhodamin-markiertem LIMB (rot), das Mikroporen enthält, teilweise gefüllt mit einer FITC-markierten Chitosan-Funktionsflüssigkeit (grün). e Größen der Oberflächen- und Innenporen in LIMB mit 2 M oder 5 M PAAm. f–h Spannungs-Dehnungs-Kurven (f), Bruchenergie (g) und fraktokohäsive Längen (h) von LIMBs mit unterschiedlichem PAAm-Gehalt. Die Werte in e, g, h stellen den Mittelwert ± sd dar (n = 40 für 2M-LIMB Surface; 20 für 2M-LIMB Internal; und 30 für 5M-LIMB Surface und Internal in e; n = 4 in g, h; The Das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen für d).

Inspiriert von den mikrostrukturierten Klebstoffen in der Natur schlagen wir hier Versiegelungen vor, die auf flüssigkeitsinfundierten mikrostrukturierten Bioadhäsiven (LIMBs) basieren, um nicht komprimierbare Blutungen zu stoppen. Solche Bioadhäsive können Vollblut schnell absorbieren und gerinnen lassen und dabei eine starke Bioadhäsion bilden, ohne dass eine Kompression erforderlich ist, um dem Blutdruck standzuhalten und Blutungsstellen abzudichten (Abb. 1b-d). Sie werden durch Infusion eines makroporösen hämostatischen Xerogels mit funktionellen Flüssigkeiten gebildet, die sich von bestehenden nichtstrukturierten Bioadhäsiven (NBs) unterscheiden. Das hämostatische Xerogel ist robust, biologisch abbaubar und fördert aktiv die Blutgerinnung. Seine Makroporen ermöglichen eine schnelle Konvektion und eine effiziente Entfernung von Grenzflächenflüssigkeiten wie Vollblut. Die infundierten Funktionsflüssigkeiten ermöglichen universelle Haftfähigkeit, antibakterielle Funktion, Lagerstabilität und einfache Anwendung. Wir zeigen eine deutlich verbesserte hämostatische Wirksamkeit und Biokompatibilität von LIMB bei Ratten und Schweinen im Vergleich zu klinisch verwendeten Gegenstücken. LIMB kann bei Bedarf auch sofort entfernt werden, ohne dass es zu einer erneuten Blutung kommt.

Zu den Designkriterien von LIMB gehören: (i) Die Matrix sollte Makroporen (~100 µm) enthalten, die die Abmessungen von Blutbestandteilen wie roten Blutkörperchen (6–8 µm) überschreiten; (ii) Die Matrix sollte hart sein, um die Poren zu tolerieren, und trocken sein, um die Grenzflächenflüssigkeit spontan aufzusaugen; (iii) Die infundierte Flüssigkeit sollte eine starke Grenzflächenbindung für die Bioadhäsion ermöglichen und innerhalb der Matrix für wiederholte Verwendung und Lagerung stabil bleiben. Nach diesen Designkriterien synthetisieren und testen wir ein makroporöses, zähes Xerogel als LIMB-Matrix. Das Modell-Xerogel wird mit kovalent vernetztem Polyacrylamid (PAAm) und physikalisch vernetztem Chitosan21 durch Gefriertrocknung gebildet; Beachten Sie, dass das PAAm mit Gelatinemethacrylat (GelMA) vernetzt ist, das enzymatisch abbaubar ist22,23,24. Das PAAm stellt ein dehnbares Netzwerk bereit, während physikalisch vernetztes Chitosan bei Verformung Energie ableiten kann. Das Xerogel ist nach der Lyophilisierung trocken und teilweise mit einer adhäsiven funktionellen Flüssigkeit infundiert, die Chitosan, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) enthält, um die Bildung von Amidbindungen zu erleichtern Gewebe (ergänzende Abbildung 1). Abhängig von den Anforderungen spezifischer Anwendungen kann die infundierte Flüssigkeit auch andere funktionelle Komponenten enthalten, beispielsweise einen antibakteriellen Wirkstoff zur Vermeidung bakterieller Infektionen. Die Produkte werden vor der Verwendung sofort eingesetzt oder bei −80 °C gelagert.

Um das erste Designkriterium zu erfüllen, entwickeln wir die Mikrostruktur von LIMB durch Optimierung der Polymerkonzentration und des Gelierungszustands. Obwohl wir Chitosan auf 1,5 % w/v fixieren, variieren wir die PAAm-Konzentrationen von 0,5 M (2,1 % w/v) bis 5 M (21 % w/v); Die resultierenden Produkte werden entsprechend der x M PAAm-Konzentration als „xM-LIMB“ bezeichnet. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Bildgebung zeigt die Oberflächen und inneren Strukturen der resultierenden Xerogele und bestätigt das Vorhandensein miteinander verbundener Makroporen in LIMB nach Einfrieren und Gefriertrocknung bei –20 ° C (ergänzende Abbildung 2a). Die Porengröße von 2M-LIMB beträgt ~200 µm und ist 10- bis 50-fach größer als die von 5M-LIMB (Abb. 1e), was auf eine umgekehrte Beziehung zwischen der PAAm-Konzentration und der Porengröße hinweist. Die poröse Struktur von 2M-LIMB ist in der gesamten Matrix gleichmäßig, wohingegen 5M-LIMB viel kleinere Oberflächenporen enthält als die in der Masse (Abb. 1e). Bemerkenswert ist, dass die Querschnittsansicht eine inhomogene Phasentrennung im Zentrum von 5M-LIMB zeigt (ergänzende Abbildung 2b). Diese Ergebnisse werden auf die hohe Steifigkeit und den Feststoffgehalt von 5M-LIMB sowie die schnelle Abkühlung an der Oberfläche zurückgeführt, wodurch das Wachstum von Eiskristallen und die daraus resultierende Porengröße begrenzt werden.

Makroporöse Strukturen sind oft anfällig für Brüche, könnten aber durch eine zähe und porenunempfindliche Matrix umgangen werden25,26. Um diesen Punkt zu testen, führen wir reine Schertests durch, um die Zähigkeit und Porenempfindlichkeit von LIMB zu charakterisieren. Nach dem Gleichgewicht in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) weist LIMB eine hohe Bruchenergie > 1500 J m−2 und eine große Verformbarkeit (Dehnungsgrenze > 6) auf (Abb. 1f, g und ergänzende Abb. 3). Die hohe Zähigkeit wird auch mit großen Hystereseschleifen bei zyklischen Zugversuchen bis zu 210 % Dehnung bestätigt (ergänzende Abbildung 4). Die dissipative Eigenschaft bleibt auch dann bestehen, wenn LIMB teilweise dehydriert ist. Diese Eigenschaften übertreffen weiche Gewebe/Organe wie Knorpel und Blutgefäße sowie den vollständig aufgequollenen zähen Klebstoff in früheren Arbeiten12,27,28. Die mechanische Leistung des Xerogels wird auf sein Doppelnetzwerkdesign zurückgeführt, bei dem Wasserstoffbrücken erhebliche Energie abbauen und dem Quellen widerstehen21,25.

Um die Empfindlichkeit gegenüber Poren als Defekte weiter zu quantifizieren, schätzen wir die kritische Länge der Fehlerempfindlichkeit, indem wir die Bruchzähigkeit (Γ) durch die Arbeit bis zum Bruch (\({W}_{f}\), die Fläche unter der Nennspannung, dividieren -Streckkurve)29. Die kritische Länge von LIMB beträgt ~5 mm (Abb. 1h) und ist damit mehr als eine Größenordnung größer als die Größe der eingebauten Makroporen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das LIMB immun gegen Makroporen und Brüche ist und damit das zweite Designkriterium erfüllt.

Eine weitere wichtige mechanische Eigenschaft ist die Steifigkeit, die die Konformität von LIMB mit Gewebeoberflächen bestimmt. Da Xerogele empfindlich auf Hydratation reagieren, werden sie mit unterschiedlichen Mengen an adhäsiver funktioneller Flüssigkeit infundiert, um LIMBs zu bilden, die auf Elastizitätsmodule getestet werden. Bei 25 % Hydratation (d. h. 25 % des LIMB-Volumens sind die infundierte Flüssigkeit) weist 2M-LIMB viel niedrigere Elastizitätsmodule (20–70 kPa) auf als 5M-LIMB (100–200 kPa) (ergänzende Abbildung 4). . Gemäß dem Dahlquist-Kriterium, dass weiche Materialien klebriger sind, wenn der Modul unter 100 kPa30 liegt, wählen wir 2M-LIMB als Standardkonfiguration für weitere Untersuchungen.

Die makroporöse und dehydrierte Natur von LIMB könnte die Aufnahme von Grenzflächenflüssigkeit ermöglichen und beschleunigen. Wir charakterisieren die Geschwindigkeit und Kapazität der Grenzflächenflüssigkeitsabsorption von LIMB und NBs. LIMB absorbiert Flüssigkeit aufgrund der Kapillarsaugung aus den großen Poren schnell, verglichen mit dem diffusionsdominierten Mechanismus von NBs im trockenen oder nassen Zustand (Abb. 2a). Der Zusammenhang zwischen Porengröße und Flüssigkeitsaufnahme lässt sich anhand des Washburn-Gesetzes11 verstehen. Die Zeit, die LIMB benötigt, um die Grenzflächenflüssigkeit aufzunehmen, ergibt sich aus:

Dabei ist \(h\) die Dicke der Flüssigkeitsschicht, \(\eta\) die Viskosität der Flüssigkeit, \(\gamma\) die Oberflächenspannung der Flüssigkeit, \(\theta\) der Kontaktwinkel, \(\varPhi\) und \(R\) sind die Porosität bzw. Porengröße der Matrix. Wie aus unseren Messungen hervorgeht, \(\varPhi \propto {R}^{1/5}\) (Ergänzende Abbildung 5), skaliert die Zeit zum Absorbieren der Flüssigkeit somit mit \({R}^{-7/5}\ ). Der Hinweis, dass sich die Flüssigkeitsaufnahme mit größeren Poren beschleunigt, stimmt gut mit unseren Ergebnissen überein.

a Flüssigkeitsabsorptionskinetik; b Kinetik der Adhäsionsbildung. c Effektive Diffusionsfähigkeit von NB und LIMB. d Digitale Fotos und Rotsignalverteilung, die LIMBs mit unterschiedlicher Oberflächenporengröße nach der Aufnahme von Vollblut zeigen (Einschubfotos). e REM-Bilder, die LIMB vor und nach der Aufnahme von Vollblut zeigen. f Adhäsionsenergie auf blutexponierten Oberflächen als Funktion der Oberflächenporengröße. g Gerinnungskinetik von Vollblut auf LIMB und NB. Je niedriger der Indexwert, desto höher ist der Grad der Blutgerinnung. h Schematische Darstellung verschiedener Benetzungsszenarien der Leberoberfläche und des Leberinneren. i Adhäsionsenergie von NB und LIMB auf der trockenen Leberoberfläche (Kapsel) und der feuchten Leberinnenseite (Parenchym) ohne Druck auszuüben. j Adhäsionsenergie auf blutexponierten Leberoberflächen ohne Druckausübung. Die Werte in a, b, f, g, i, j stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 3 für a, b; n = 4 für f, i, j; n = 6 für NB und 4 für LIMB in g; The Das Experiment wurde viermal unabhängig voneinander wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen für e). Statistische Signifikanz und P-Werte wurden durch zweiseitigen T-Test bestimmt.

Um die Wirkung der Grenzflächenflüssigkeit auf die Adhäsion weiter zu messen, messen wir die Adhäsionsenergie von LIMB auf der Kollagenhülle und variieren dabei die Dicke des PBS an der Grenzfläche. Die Kollagenhülle ahmt die Gewebeoberfläche nach und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Grenzflächenflüssigkeit, um sie für physiologische Relevanz an die Schleimdicke anzupassen31. Wir stellen fest, dass die Zeit zum Einleiten der Adhäsion (\({t}_{{{{{\rm{ad}}}}}}}\)) für LIMB bei gegebener Dicke der Grenzflächenflüssigkeit (\) innerhalb von 15 s liegt. ({H}_{{{{{{\rm{if}}}}}}}\)) von ~250 μm; wenn \({H}_{{{{{{\rm{if}}}}}}}\) auf ~750 μm ansteigt, \({t}_{{{{{{\rm{ad}} }}}}}\) wird auf 130 s verlängert (Abb. 2b). Im Gegensatz dazu bildet NB innerhalb von 420 s keine Adhäsion. Da die Adhäsion mit der Reinigung der Grenzflächenflüssigkeit beginnt, können wir die effektive Diffusionsfähigkeit abschätzen

Die Diffusionsfähigkeit von LIMB beträgt ~4,2\(\times\)10−9 m2/s und ist damit 30-fach höher als die von NB (Abb. 2c).

Da sich Vollblut von anderen Körperflüssigkeiten hinsichtlich der Blutzellen und der Gerinnungsfähigkeit unterscheidet, untersuchen wir die physikalischen und hämostatischen Wechselwirkungen zwischen LIMB und Blut. Wir untersuchen zunächst die Blutabsorptionsfähigkeit als Funktion der Oberflächenporengröße. Wie erwartet absorbiert 2M-LIMB mit größeren Poren das gesamte Blut, während 5M-LIMB aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen kleinen Poren und Blutzellen nur Plasma absorbiert. Dieser Befund wird durch den Vergleich des roten Signals, einem Indikator für rote Blutkörperchen (RBCs), zwischen den beiden getesteten Bedingungen gestützt (Abb. 2d). Die REM-Bildgebung zeigt, dass Erythrozyten in 2M-LIMB in der gesamten Tiefe der porösen Matrix zu finden sind (Abb. 2e und ergänzende Abb. 6). Ein nachgeschalteter Effekt der Blutabsorption wird durch die Tatsache bestätigt, dass 2M-LIMB besser an der Leber haftet (Abb. 2f). Diese Ergebnisse bestätigen unsere Hypothese, dass große offene Poren die Blutzellen effektiv absorbieren und die Bioadhäsion fördern können.

Ein weiterer Vorteil von LIMB ist seine Fähigkeit, die Blutgerinnung in der Nähe und innerhalb der LIMB-Matrix zu fördern. Diese Gerinnungsfähigkeit wird mit einem Blutgerinnungsindex quantifiziert, der die Menge an freien Erythrozyten widerspiegelt, die sich nicht in Gerinnseln befinden, gemäß einem zuvor berichteten Protokoll2,32,33,34. Der Blutgerinnungsindex korreliert umgekehrt mit dem Grad der Blutgerinnselbildung. Wir stellen fest, dass die Gerinnung innerhalb von Sekunden beim Kontakt zwischen LIMB und Vollblut erfolgt (Abb. 2g). Dieses Phänomen ist bei NB nicht zu beobachten, obwohl das gleiche Chitosan-Polymer mit bekannter hämostatischer Funktion vorhanden ist. Wir tragen somit zum Unterschied zur porösen und dehydrierten Natur der LIMB-Matrix bei, die Erythrozyten und Blutplättchen im absorbierten Blut kontaktiert und konzentriert und so die Gerinnungskaskade erheblich beschleunigt35. Neben der Blutstillung könnte die Gerinnselbildung dazu beitragen, die Poren innerhalb von LIMB zu verstopfen, um eine Leckage durch die Membran zu vermeiden und die Dichtleistung zu verbessern, wie später gezeigt wird. Die Gerinnungsfähigkeit unterscheidet LIMB von den bioadhäsiven Dichtstoffen, die in früheren Arbeiten ausschließlich auf physikalischen Barriereeffekten beruhten7,8.

Viele Gewebeoberflächen sind mit biologischen Substanzen wie Schleim und Blut verunreinigt/bedeckt, was die Leistung von Bioadhäsiven beeinträchtigt. Nehmen wir als Beispiel die Leber; Der äußere Teil, die Glisson-Kapsel, kann unter traumatischen und chirurgischen Bedingungen mit Blut bedeckt sein, während der innere Teil, das Parenchym, mit einer viskosen interstitiellen Flüssigkeit überzogen ist (Abb. 2h). Wir testen die Bioadhäsionsleistung von LIMB auf diesen Oberflächen ohne Kompression und vergleichen sie mit NB (ergänzende Abbildung 7). Auf der Oberfläche der trockenen Organkapsel ist die Adhäsionsenergie von LIMB 2,4-mal höher als die von NB (Abb. 2i). Ein höherer Kontrast ist auf dem feuchten Parenchym zu finden, wo die Adhäsionsenergie von ~40 J m−2 für LIMB mehr als viermal höher ist als ~9 J m−2 für NB. Beachten Sie, dass die schwächere Adhäsion am Parenchym als an der Organkapsel wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass das Parenchym fragiler ist. Eine ähnliche Schlussfolgerung ergibt sich, wenn die Oberflächen mit Blut verunreinigt sind. Die Leistung von NB verschlechtert sich, da die Blutbestandteile den Kontakt zwischen NB und dem Gewebe beeinträchtigen. Bei LIMB wird keine solche Verringerung beobachtet, da es das Blut effektiv absorbieren und entfernen kann, wie oben gezeigt (Abb. 2j).

Neben der Leber kann LIMB auf verschiedenen Oberflächen eine starke und universelle Haftung ohne Kompression erzielen. Beispielsweise ist die Haftung zwischen LIMB und Schweinehaut unabhängig vom ausgeübten Druck (0–8 kPa) (Abb. 3a). Eine ähnliche Adhäsionsleistung findet sich bei anderen Geweben wie der menschlichen Aorta und dem Schweineherz, mit oder ohne Druck (Abb. 3b). Als Demonstration bildet LIMB eine stabile Haftung an einem blutexponierten Schweineherz, ohne dass eine Kompression erforderlich ist (ergänzende Abbildung 8 und Film 1). Zusätzlich zu Geweben zeigt LIMB eine druckunempfindliche Haftung auf Hydrogelen und Elastomeren (Abb. 3b). Ohne Druck kann LIMB eine starke Haftung erzielen, die die von Fibrinklebern und medizinischen Klebebändern übertrifft (10–20 J m−2)21,27. Unter den getesteten Hydrogelen sind Gelatine-Hydrogele zu zerbrechlich, um die Kompression zur Adhäsionsbildung zu überstehen. Die robuste druckunempfindliche Haftung ist auf die einzigartige Struktur von LIMB zurückzuführen: Die Xerogelmatrix kann Grenzflächenflüssigkeiten spontan absorbieren und mithilfe der infundierten Flüssigkeit einen engen Kontakt und eine starke Bindung mit den Substraten herstellen. Diese Funktion ermöglicht einen breiten Einsatz von LIMB in verschiedenen medizinischen und technischen Umgebungen.

Ein LIMB ist im Niederdruckbereich druckunempfindlich. b Adhäsionsleistung auf verschiedenen Substraten mit und ohne Druckanwendung (~60 kPa) zur Bildung einer Anfangshaftung. Die Adhäsion an der menschlichen Aorta unter Druck wurde aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Gewebeproben nicht gemessen. c Adhäsionsenergie als Funktion des Hydratationszustands. d Benzalkoniumchlorid (BZK) als antimikrobielle Funktionsflüssigkeit kann LIMB mit antimikrobieller Funktion ermöglichen, wie durch die LIVE/DEAD-Tests an P. aeruginosa und S. aureus nachgewiesen. e Lebensfähigkeit und f Vergleiche der Anhaftung lebender Zellen zwischen LIMB und LIMB, beladen mit BZK. g EDC-Halbwertszeit bei Lagerung in verschiedenen Klebstoffen. h Die infundierte Flüssigkeit hat einen Reservoireffekt, der eine wiederholbare Haftung ermöglicht. i Infundierte Flüssigkeit kann für eine längere Haltbarkeit bei niedriger Temperatur in LIMB gelagert werden. Die Werte in a–c, e–i stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 4 für a–c, g–i; n = 12 für e, f). Statistische Signifikanz und P-Werte wurden durch einen zweiseitigen T-Test für den Vergleich zwischen zwei Gruppen und eine einfaktorielle ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Tests für den Vergleich zwischen mehreren Gruppen bestimmt.

Die Leistung und Funktionalität von LIMB sind mit der infundierten Flüssigkeit einstellbar. Da oben gezeigt wurde, dass die Aufnahme von Grenzflächenflüssigkeiten die Adhäsion beeinflusst, gehen wir davon aus, dass die Menge der infundierten Flüssigkeit oder der Hydratationszustand die Adhäsionsleistung von LIMB beeinflussen könnten. Wir laden und testen LIMB mit unterschiedlichen Mengen der adhäsiven Funktionsflüssigkeit (0–100 %) auf nassem Schweineherz (Abb. 3c). Bei 0 % hydratisiertem LIMB wird die Oberfläche des zunächst trockenen LIMB mit der klebenden Funktionsflüssigkeit grundiert und sofort auf das Gewebe aufgetragen. Wie erwartet skaliert die Adhäsionsenergie umgekehrt mit dem Hydratationszustand (Abb. 3c). Eine ähnliche Korrelation besteht zwischen der Adhäsionsbildungsgeschwindigkeit und dem Hydratationszustand, wobei 0 % hydratisiertes LIMB bei Kontakt eine sofortige Adhäsion mit feuchten Geweben bildet, während 100 % hydratisiertes LIMB dies nicht tut (ergänzende Abbildung 9). Die Viskosität der adhäsiven Funktionsflüssigkeit scheint die Adhäsionsleistung zu beeinträchtigen, ihre Rolle ist jedoch im Vergleich zur Beladungsmenge der Funktionsflüssigkeit von geringerer Bedeutung (ergänzende Abbildung 10).

Die infundierte Flüssigkeit kann auch LIMB funktionalisieren. Wir demonstrieren diese Möglichkeit, indem wir LIMB mit einem antimikrobiellen Wirkstoff, 5 % Benzalkoniumchlorid (BZK), beladen, um die antibakterielle Funktion zu erzielen, die in vielen chirurgischen Eingriffen erwünscht ist36 (Abb. 3d). Wir testen die antimikrobiellen und Antifouling-Funktionen, indem wir BZK-beladenes LIMB zwei pathogenen Modellbakterien aussetzen: P. aeruginosa und S. aureus. Im Vergleich zum unberührten LIMB weist BZK-LIMB eine stärkere Wirkung auf die Abtötung von Bakterien und die Hemmung der Anhaftung auf (Abb. 3e, f). Die Ergebnisse zeigen die Einstellbarkeit und Modularität von LIMB mit dem Flüssigkeitsinfiltrationsdesign.

Das einzigartige Design von LIMB trägt auch dazu bei, wichtige Übersetzungsaspekte hinsichtlich Benutzerfreundlichkeit und Speicherung zu berücksichtigen. Die Minimierung chemischer Reaktionen zwischen der Flüssigkeit und der Matrix ist eine Voraussetzung für die Verlängerung des Zeitfensters für die Nutzung und die Verlängerung der Stabilität von LIMB. Zu diesem Zweck werden sowohl die Matrix als auch die infundierte Flüssigkeit von LIMB auf Basis von Chitosan (primäraminreich) ausgewählt; Daher würde keine Carbodiimidreaktion stattfinden. Um diesen Punkt zu testen, bereiten wir zum Vergleich auch ein weiteres LIMB aus Alginat (reich an Carbonsäuren) vor. Die Chitosan- und Alginat-basierten LIMB werden mit der gleichen adhäsiven Funktionsflüssigkeit (Chitosan, EDC und NHS) beladen und bei 4 °C in versiegelten Behältern gelagert. Wir charakterisieren die Adhäsionsenergie von LIMBs auf Schweinehaut als Funktion der Lagerdauer. Das auf Chitosan basierende LIMB behält seine Haftfähigkeit auch nach 24 Stunden bei (ergänzende Abbildung 11). Eine Erhöhung der Lagertemperatur verringert tendenziell die Stabilität von LIMB. Die Adhäsionsenergie von bei Raumtemperatur gelagertem LIMB nimmt mit der Lagerdauer ab, was mit der Hydrolyse von Haftmitteln wie EDC zusammenhängen kann. Dennoch behält das gelagerte LIMB 6 Stunden lang eine nennenswerte Haftfähigkeit (ergänzende Abbildung 12), was den meisten chirurgischen Eingriffen gerecht wird. Im Vergleich dazu weist das alginatbasierte LIMB eine viel kürzere Halbwertszeit auf, da die infundierte Flüssigkeit über Carbodiimidreaktionen mit der alginatbasierten Matrix reagiert (Abb. 3g); Bei NB wird der Verlust der Haftfähigkeit auf den Mangel an Haftreagenzien zurückgeführt.

Aufgrund der bestätigten Kompatibilität wird davon ausgegangen, dass LIMB die Haftung während der Neupositionierung und Langzeitlagerung beibehält. Einerseits können die in Makroporen gespeicherten Haftvermittler die Oberfläche für eine wiederholbare Haftung auffüllen. Wir messen die Adhäsionsenergie, indem wir dasselbe zu 50 % hydratisierte LIMB dreimal hintereinander an frischen Schweinelebern anbringen und so das Szenario der Neupositionierung nachahmen. LIMB behält bei allen Wiederholungen eine nennenswerte Haftung (>30 J m−2). Im Gegensatz dazu sinkt die Adhäsionsenergie von NB beim dritten Versuch auf ein Sechstel der beim ersten Versuch (Abb. 3h). Solch ein herausragendes Merkmal ermöglicht die Korrektur der LIMB-Position für eine optimale Platzierung. Andererseits könnte LIMB über einen längeren Zeitraum bei −80 °C gelagert werden, was üblicherweise für die Lagerung von Therapeutika und Chemikalien verwendet wird. Die niedrige Temperatur kann den Abbau der Klebemittel hemmen und ihre Stabilität innerhalb von LIMB weiter verbessern. Um diese Möglichkeit zu testen, untersuchen wir die Adhäsionsleistung von 25 % hydratisiertem LIMB nach Lagerung auf blutexponierten Leberkapseln ohne Anwendung von Kompression und stellen fest, dass LIMB über 90 Tage hinweg eine hohe Adhäsion beibehält (Abb. 3i). Diese kollektiven Attribute unterstützen den Komfort und die Benutzerfreundlichkeit von LIMB.

Wir kombinieren eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Tests, um die Sicherheit und Wirksamkeit von LIMB zur Blutungskontrolle zu bewerten. Obwohl LIMB hydrophiles PAAm enthält, kann das physikalisch vernetzte Chitosan-Netzwerk das Anschwellen des Hybridnetzwerks wirksam unterdrücken. Infolgedessen weist LIMB beim Eintauchen in PBS nahezu keine Schwellung auf (Abb. 4a und ergänzende Abb. 13). Der Einbau eines abbaubaren Vernetzers für das PAAm-Netzwerk und des biologisch abbaubaren Chitosan macht LIMB biologisch abbaubar. Ein stetiges Abbauprofil von LIMB wird beobachtet, wenn es einer Enzymlösung ausgesetzt wird, die Lysozym und Kollagenase in physiologischen Mengen enthält (Abb. 4b). Die biologische Abbaubarkeit ist für die hämostatische Anwendung von entscheidender Bedeutung, um eine Entfernung und sekundäre Operationen zu vermeiden23,37. Wir bewerten auch die Zytokompatibilität von LIMB gemäß dem Standard der Internationalen Organisation für Normung (ISO) 10993-5: Tests für den In-vitro-Zytotoxizitätsstandard. Es werden immortalisierte menschliche Stimmlippenfibroblasten (hVFFs) verwendet. Die In-vitro-Zellkultur zeigt über eine 7-Tage-Kultur eine Zelllebensfähigkeit von über 98 %, was die Zytokompatibilität von LIMB beweist (Abb. 4c).

a Schwellung der Gliedmaßen in PBS. b Verbleibendes Hydrogelgewicht über die Zeit, wenn die Hydrogele PBS und PBS mit Enzymen (Kollagenase und Lysozym) ausgesetzt werden. c LIVE/DEAD-Assay von Zellen in Kontrolle und LIMB. Kontrolle: Zellkultur auf einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen. d Schematische und histologische Bilder, die die Implantate und das umliegende Gewebe 3, 7 und 28 Tage nach der Implantation zeigen. Die hier verwendeten LIMBs waren 2M-LIMB, wobei 25 % des Volumens mit adhäsiver Funktionsflüssigkeit infundiert waren. e Bioverteilung der Abbauprodukte von LIMB in wichtigen Organen über einen Zeitraum von 28 Tagen. Zur Darstellung der Fluoreszenz wurden FITC-markierte LIMBs verwendet. f Durchschnittliche Fluoreszenzintensität über die Zeit aus der Bioverteilung. e Schematische Darstellung der Berstdruckmessung. f Berstdruck von LIMB mit und ohne infundierte Flüssigkeit. LIMB ohne infundierte Flüssigkeit weist keine spürbare Dichtfunktion auf, während LIMB mit infundierter Flüssigkeit dem Durchfluss bei angemessenem Berstdruck widersteht. g Berstdruck von 25 % hydratisiertem LIMB mit und ohne steifem Träger. Die Werte in a–c, f, h, i stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 4 für a–c, h; n = 2 biologisch unabhängige Tiere für e, f; n = 5 für keine infundierte Flüssigkeit und 6 für mit infundierte Flüssigkeit Flüssigkeit in i; Das Experiment wurde viermal unabhängig voneinander wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen für d). Statistische Signifikanz und P-Werte wurden durch zweiseitigen T-Test bestimmt.

Die In-vivo-Biokompatibilität des LIMB wird durch subkutane Implantation bei Ratten über 28 Tage untersucht und mit NB verglichen. Die Explantate behalten nach der Implantation ihre körperliche Integrität (ergänzende Abb. 14 und Abb. 15). Histologische Schnitte zeigen eine sehr dünne Kapsel mit seltenen Riesenzellen vom Fremdkörpertyp an der Grenzfläche zwischen dem Gewebe und allen Implantaten (Abb. 4d); Es gibt keine Hinweise auf eine aktive oder chronische Entzündung oder allergische eosinophile Reaktionen. In Übereinstimmung mit dem Zytokompatibilitätstest kommen die Ergebnisse zu dem Schluss, dass LIMB und NB in ​​vivo vergleichbare minimale Entzündungsreaktionen hervorrufen. Die Toxizität von EDC ist konzentrationsabhängig; Es wurde festgestellt, dass EDC bei Verwendung in niedrigen Konzentrationen keine schwere Toxizität hervorruft23,27,38,39,40 (Ergänzungstabelle 1). Angesichts der starken Adhäsions- und Versiegelungswirkung von EDC überwiegen seine Vorteile bei der Behandlung lebensbedrohlicher Situationen seine lokale Zytotoxizität. Es ist auch erwähnenswert, dass EDC durch andere bioadhäsive Wirkstoffe wie Transglutaminase41, oxidierte Polysaccharide42 und Catechol-modifizierte Biopolymere43 ersetzt werden könnte, die als biokompatibel gelten und in der Lage sind, LIMB mit biologischen Geweben zu verbinden. LIMB als Plattformtechnologie kann an eine Vielzahl von Klebemitteln angepasst werden.

Wir untersuchen auch den biologischen Abbau in vivo und bewerten die Toxizität der Abbauprodukte. Durch die Verwendung von FITC-markierten LIMBs und der IVIS-Bioverteilungsbildgebung kartieren wir den Clearance-Weg von LIMB über 28 Tage (Abb. 4e). Wie erwartet erfolgt die Clearance hauptsächlich über Leber und Nieren (Abb. 4f). Es wird auch eine langsame und stetige Größenänderung beobachtet (ergänzende Abbildung 15). Bei der histologischen Analyse gibt es am 28. Tag keine Anzeichen einer systematischen Toxizität für wichtige Organe (ergänzende Abbildung 16), was auf die Sicherheit von LIMB für eine Langzeitimplantation schließen lässt.

Die Kombination aus hämostatischer und biologischer Adhäsionsleistung ermöglicht es LIMB, die lateralen und transmembranen Flüsse von Körperflüssigkeiten abzudichten. Obwohl die makroporöse Struktur Leckagen befürchtet, könnte die Infiltration der adhäsiven funktionellen Flüssigkeit innerhalb von LIMB zu Flüssigkeitseinlasseffekten führen, um die Abdichtung sicherzustellen44,45. Um diesen Punkt zu beweisen, testen wir den Berstdruck von LIMB als Funktion der Flüssigkeitsinfiltration. Wenn 25 % der Poren mit Flüssigkeit infundiert sind, weist das 25 %-LIMB einen hohen Berstdruck von ~66 mmHg auf, im Gegensatz zu fast keiner Versiegelung des LIMB ohne infundierte Flüssigkeit (Abb. 4g, h). Die gute Versiegelung ist auf die infundierte Flüssigkeit zurückzuführen, die die Makroporen verschließt und so das Austreten von Blut verhindert. Bei Tests an Herzgewebe erreicht das 25 %-LIMB einen Berstdruck von ~95 bzw. ~308 mmHg mit bzw. ohne starre Trägerunterstützung und zeigt eine hervorragende Dichtungsleistung (Abb. 4i). Die Versiegelung wird verlängert, da gezeigt wird, dass die Haftung am Gewebe auch nach mehr als 8-tägigem Eintauchen in PBS bestehen bleibt (Zusatzfilm 2).

Wir bewerten die Sicherheit und Wirksamkeit von LIMB in verschiedenen Tiermodellen mit physiologischer Relevanz im Vergleich zum kommerziellen resorbierbaren hämostatischen Gelatineschwamm SURGIFOAM (Ethicon). Tiefe Wunden mit kleinen Eingängen, die beispielsweise durch Kleinwaffenfeuer verursacht werden, schränken den direkten Kontakt zwischen Blutstillungsmitteln und blutenden Gefäßen ein46. Die daraus resultierende nicht komprimierbare Blutung hat mit aktuellen hämostatischen Technologien nur begrenzte Behandlungsergebnisse2,32. Wir verwenden ein Rattenleber-Volumendefektmodell (4 mm Durchmesser und 3 mm Tiefe), um die Wirksamkeit von LIMB als implantierbares Hämostatikum zum Stoppen nicht komprimierbarer Blutungen zu bewerten (Abb. 5a und ergänzende Abb. 17). Der Leberdefekt erhält LIMB oder SURGIFOAM der gleichen Größe. Die hämostatische Wirksamkeit von LIMB zeigt sich in einem geringen Blutverlust (99,8 mg) und einer kurzen Zeit bis zur Blutstillung (31,5 s). Im Vergleich zu 517,1 mg und 165,8 s für SURGIFOAM erreicht unser Material insgesamt eine 5-fache Verbesserung bei beiden Kriterien (Abb. 5b, c).

a Abbildung eines Modells einer nicht komprimierbaren Leberblutung mit volumetrischem Defekt an einer Ratte ohne Druckanwendung. b Blutverlust und c Vergleich der Zeit bis zur Blutstillung. d Histologische Bilder, die die Implantate nach 2 Wochen zeigen. „Dreieck“-Symbole weisen auf Riesenzellen vom Fremdkörpertyp hin; „Pfeil“-Symbole weisen auf Lymphozyten hin; „Stern“-Symbole weisen auf Eosinophile hin. e–h Vergleiche der Immunantworten. i Illustration einer tiefen Schnittblutung in der Leber einer Ratte. j, Blutverlust und k, Zeit bis zur Blutstillung, Vergleiche zwischen verschiedenen Hämostatika. l Vergleich der Adhäsionsstärke nach Blutstillung bei ~120 s. m Illustration einer tiefen Schnittblutung an der Schweineleber. n Blutverlust und o, Zeit bis zur Blutstillung im Vergleich. Die Werte in b, c, e–h, i–l, n, o stellen den Mittelwert ± sd dar (n = 4 für b, c; n = 6 für SURGIFOAM und 7 für LIMB in e–h; n = 5 für Gaze , Combat Gauze und LIMB und 6 für NB in ​​j, k; n = 6 für NB und 4 für LIMB in l; n = 7 für Gaze und 6 für LIMB in n, o; unabhängige Stichproben). Die statistische Signifikanz und die P-Werte wurden durch einen zweiseitigen t-Test für b, c, e–h, i–l und einen einseitigen t-Test für n, o bestimmt.

Zusätzlich zur akuten Reaktion wird die langfristige Biokompatibilität in vivo durch Untersuchung der implantierten Materialien für 2 Wochen nach der Blutstillung bewertet (Abb. 5d). Es werden vier Messgrößen potenzieller Immunreaktionen verwendet, darunter die Dicke der fibrotischen Kapsel (FC), die Riesenzelldichte für Fremdkörperreaktionen, die Lymphozytendichte für Entzündungsreaktionen und die Eosinophilendichte für Allergiereaktionen. Die statistische Analyse belegt einen erheblichen Vorteil von LIMB gegenüber SURGIFOAM in allen gemessenen Metriken. Genauer gesagt induziert LIMB eine dünne FC (~53 µm), sehr milde Fremdkörperreaktionen, minimale Entzündungen und allergische Reaktionen. Im Vergleich dazu führt SURGIFOAM zu einer dicken FC (~431 µm) und einem hohen Grad an Fremdkörper- und Entzündungsreaktionen; Die Allergiereaktion ist moderat, aber deutlich höher als bei LIMB (Abb. 5e-h). Insgesamt erweist sich LIMB als vielversprechend für den Einsatz als implantierbare Hämostatika zur Stillung nicht komprimierbarer Blutungen.

Wir testen LIMB außerdem zur Behandlung tiefer Schnittblutungen. Es werden sowohl Ratten- als auch Schweineleber-Schnittmodelle verwendet; Hinweis: Zum Vergleich sind Standardgaze und ein im Handel erhältlicher Combat Gaze (QuickClot) enthalten. Um die druckunempfindliche Blutstillung zu testen, werden die Hämostatika stabil an der Blutungsstelle positioniert und keinem Druck ausgesetzt43. Für das Rattenmodell wird an der Leber ein Einschnitt von 7 mm Länge und 3 mm Tiefe angelegt. Der daraus resultierende Blutverlust ist bei LIMB im Vergleich zu anderen Hämostatika, einschließlich NB, Standardgaze und Combat Gauze, deutlich geringer (Abb. 5i, j und ergänzende Abb. 18). Aufgrund des durchscheinenden Aussehens ist es schwierig, die genaue Zeit bis zur Blutstillung von LIMB zu messen. Alle getesteten LIMBs stoppen die Blutung innerhalb von 120 Sekunden nach der Kontrolluntersuchung und sind viel schneller als andere Produkte (Abb. 5k). Wir verwenden einen „Pull-Off“-Test, um die Adhäsionsstärke von LIMB an der blutenden Leber etwa 120 s vor der Bildung chemischer Bindungen zu messen. LIMB wird allein durch Kapillarsaugung sicher an der verletzten Leber befestigt und weist eine deutlich höhere Adhäsionsstärke als NB auf (Abb. 5l). Die Adhäsionsbildung weist darauf hin, dass LIMB das Grenzflächenblut erfolgreich entfernt hat. Für das Schweinemodell wird ein Einschnitt von 15 mm Länge und 10 mm Tiefe an der Leber angelegt (Abb. 5m und ergänzende Abb. 19). Der durchschnittliche Blutverlust für Gaze und LIMB beträgt 69,5 bzw. 17,1 ml (Abb. 5n). Wir beobachten auch die Zeit bis zur Blutstillung innerhalb einer 10-minütigen Cut-off-Zeit für beide Gruppen. Erfolgreiche Blutstillungsereignisse sind mit Punkten und erfolglose Blutstillungsereignisse mit Kreuzen gekennzeichnet (Abb. 5o); 4 von 6 mit LIMB behandelten Schweineverletzungen hören innerhalb von 10 Minuten auf zu bluten, aber nur 2 von 7 mit einfacher Gaze behandelten Verletzungen sind erfolgreich. Die erfolgreiche Blutstillungsrate beträgt 66,7 % für LIMB und 28,6 % für Gaze, eine über 2,3-fache Verbesserung. Die kombinierten Ergebnisse belegen die Wirksamkeit von LIMB bei der Stillung tiefer Schnittblutungen.

LIMB kann bei Bedarf sofort und sicher entfernt werden, was bei bestehenden Bioadhäsiven einen ungedeckten Bedarf darstellt. Die Haftung von LIMB erfolgt in zwei Phasen. In der ersten Phase, etwa in den ersten 2 Minuten nach der Platzierung, entsteht die Haftung hauptsächlich durch die kapillare Ansaugung aus den trockenen Poren von LIMB. Diese physikalischen Wechselwirkungen können durch Benetzen von LIMB mit Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) leicht deaktiviert werden. Wir zeigen, dass LIMB sofort nach dem Benetzen sicher von der verletzten Leber abgezogen werden kann (ergänzende Abbildung 20 und Film 3). Ebenso gilt diese Methode für Umlagerungsverfahren, da diese in der Regel innerhalb von 1–2 Minuten entschieden werden. LIMB lässt sich durch das Anfeuchten leicht von der Oberfläche lösen oder direkt abziehen.

Über dieses Zeitfenster hinaus ist LIMB immer noch mit Entfernungsmitteln entfernbar, um an der Grenzfläche gebildete Bindungen zu spalten. Die Entfernungsmittel werden benötigt, da kovalente Bindungen aufgrund von EDC nach 2 Minuten auftreten und nach etwa 10 Minuten ein Plateau erreichen. Sobald sich chemische Bindungen gebildet haben, kann LIMB nicht einfach durch einfaches Benetzen vom Gewebe gelöst werden (Zusatzfilm 4). Wir demonstrieren zwei Entfernungsmittel: Essigsäurelösung (0,1 M) und Lysozymlösung (75 mg/ml). Essigsäure kann diese Bindungen schnell aufbrechen und sogar Chitosan-Netzwerke an der Grenzfläche und innerhalb von LIMB auflösen, die für die Nasshaftung verantwortlich sind (Zusatzfilm 5); Beachten Sie, dass die verwendete Essigsäurelösung eine niedrige Konzentration aufweist und anschließend schnell mit Kochsalzlösung neutralisiert werden kann. Alternativ wirkt Lysozym wie eine Schere, um die Chitosanketten zu zerschneiden. Nach 10-minütiger Einwirkung von Lysozym ist die Haftung zwischen LIMB und der verletzten Leber merklich geschwächt (Zusatzfilm 6). Bemerkenswert ist, dass wir nach der Entfernung von LIMB weder mit Essigsäure noch mit Lysozym eine erneute Blutung beobachteten. In-vitro-Experimente bestätigten auch die Wirksamkeit von Entfernungsmitteln für die bedarfsgesteuerte LIMB-Entfernung (ergänzende Abbildung 21). Wir führen dieses Phänomen auf die Fähigkeit von LIMB zurück, die Koagulation zu fördern, ein Vorteil gegenüber bestehenden bioadhäsiven Versiegelungsmitteln, die die Blutungsstelle nur physisch blockieren.

In diesem Artikel haben wir ein mikrostrukturiertes hämostatisches Bioadhäsivdesign beschrieben, bei dem die bioinspirierte Architektur, robuste Klebstoffe und die Flüssigkeitsinfiltration genutzt werden. Die resultierenden mikrostrukturierten Bioadhäsive können eine sofortige und starke Haftung auf bioverschmutzten Oberflächen aufbauen, ohne dass eine Kompression erforderlich ist. Die Bioadhäsive sind biologisch abbaubar, einfach anzuwenden und langfristig lagerstabil. Die Funktionalität der Klebstoffe lässt sich leicht mit der infundierten funktionellen Flüssigkeit abstimmen. Ihre Biokompatibilität und hämostatische Wirksamkeit übertreffen mehrere bestehende hämostatische Wirkstoffe und Bioadhäsive, wie der verringerte Blutverlust bei nicht komprimierbaren und tiefen und schmalen Blutungen in kleinen und großen Tiermodellen zeigt. Sie können bei Bedarf auch sofort und sicher entfernt werden. Wir gehen davon aus, dass das beschriebene Designprinzip und das Materialsystem die Entwicklung und Umsetzung von Bioadhäsiven und hämostatischen Materialien zur Behandlung von Blutungen vorantreiben werden.

Alle Chemikalien wurden gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Zu den Materialien für die Hydrogelsynthese gehören: Acrylamid (AAm, Sigma, A9099), N,N′-Methylenbisacrylamid (MBAA; Sigma-Aldrich, M7279), Ammoniumpersulfat (APS, Sigma-Aldrich, A3678), Tetramethylethylendiamin (TEMED, Sigma- Aldrich, T7024), Chitosan (Deacetylierungsgrad, DDA: 95 %, mittleres und hohes Molekulargewicht, Lyphar Biotech), Alginat (hohes Molekulargewicht, I-1G, KIMICA Corporation), Natriumbicarbonat (Fisher Scientific, S233), Natrium Phosphat einbasisch (NaH2PO4, Sigma-Aldrich, S8282), Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4, Sigma-Aldrich, S7907), Essigsäure (Sigma-Aldrich, A6283), Benzalkoniumchlorid (BZK, Fisher Scientific, AA4133914). Gelatinemethacrylat (GelMA) wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll47 synthetisiert und als abbaubarer Vernetzer verwendet. Zu den Materialien für Adhäsionsexperimente gehören: N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC, Sigma-Aldrich, 03450), N-Hydroxysuccinimid (NHS, Sigma-Aldrich, 130672), Kollagenhülle (Weston) und VHB (3 Mio.). Leber-, Herz- und Hautgewebe von Schweinen wurden in einem örtlichen Lebensmittelgeschäft gekauft. Zu den Materialien zur Synthese fluoreszierend markierter Hydrogele gehören: Fluorescein-5-Isothiocyanat (Thermo Fisher, F1907), Rhodamin-B-Isothiocyanat (Cayman Chemical, 20653), wasserfreies Methanol (Fisher Scientific, A412-1), 0,22 µm PES-Filter (Fisher Scientific, 13100106). ) und 3,5 K MWCO-Dialyseschläuche (Fisher Scientific, PI88244).

Sowohl Acrylamid- als auch Chitosanpulver wurden zunächst in 0,2 M Essigsäure mit 3,3 mol/L bzw. 2,5 % gelöst. GelMA wurde der AAm-Chitosan-Lösung als abbaubarer Vernetzer in einer Konzentration von 0,11 % w/v zugesetzt. Eine Gelierlösung zur Auslösung der physikalischen Vernetzung von Chitosan wurde hergestellt, indem zunächst 0,1 M Na2HPO4 und 0,1 M NaH2PO4 in einem Volumenverhältnis von 50:3 gemischt wurden, gefolgt von der Zugabe von Natriumbicarbonat bis zu einer Endkonzentration von 0,306 M. APS wurde hinzugefügt der Gelierlösung in einer Konzentration von 0,225 % als Initiator zugesetzt. Beide Lösungen wurden entgast, schnell im Volumenverhältnis 3:2 (Vorläuferlösung versus Gelierlösung) gemischt und zur Gelierung über Nacht bei Raumtemperatur in eine Glasform gegossen.

NB wurde zunächst auf der Grundlage des oben genannten Protokolls erstellt. Um Poren zu erzeugen, wurde NB zunächst einen Tag lang in entionisiertem (DI) Wasser dialysiert, um nicht umgesetzte Reagenzien zu entfernen. 2M-Xerogel wurde vervollständigt, indem dialysiertes NB zunächst 24 Stunden lang in einen Gefrierschrank mit –20 °C gegeben wurde, um Eiskristalle zu bilden, und dann gefriergetrocknet wurde. Für 5 M-Xerogel wurde das gleiche Verfahren angewendet, mit der Ausnahme, dass die Anfangskonzentration von Acrylamid in der Vorläuferlösung 8,3 M betrug. Für 0,5 M-Xerogel wurden sowohl Acrylamid- als auch Chitosanpulver zunächst in 0,2 M Essigsäure bei 0,83 mol/L gelöst bzw. 2,5 %. GelMA wurde der AAm-Chitosan-Lösung mit 0,11 % w/v zugesetzt. Anschließend wurde der Polymerlösung TEMED in einer Konzentration von 0,5 % zugesetzt. APS wurde in entionisiertem Wasser in einer Konzentration von 0,625 % gelöst, um die Initiatorlösung zu bilden. Die Lösungen wurden vor dem Einfrieren auf 4 °C abgekühlt, um die Polymerisation zu verlangsamen. Die Lösungen wurden dann schnell im Volumenverhältnis 3:2 (Vorläuferlösung versus Initiatorlösung) gemischt und in eine vorgekühlte (–20 °C) Glasform gegossen. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei −20 °C wurden die Gele aus der Form genommen und in einer vorgekühlten (4 °C) 0,306 M Natriumbicarbonatlösung aufgetaut. Die Gele wurden dann zunächst einen Tag lang in entionisiertem Wasser dialysiert, um nicht reagierte Reagenzien zu entfernen, bevor sie lyophilisiert wurden, um das Xerogel für die Verwendung der LIMB-Matrix zu bilden.

Xerogel auf Alginatbasis wurde zunächst durch Auflösen von Acrylamid- und Alginatpulvern in entionisiertem Wasser hergestellt, um eine Konzentration von 2 mol/L bzw. 2,256 % zu erreichen. MBAA wurde der AAm-Alginat-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 0,0006:1 (das Gewicht von MBAA gegenüber Acrylamid) zugesetzt, um die Vorläuferlösung zu bilden. Eine Gelierlösung wurde durch Auflösen von 6,87 % CaSO4 und 3,58 % APS in entionisiertem Wasser hergestellt. Anschließend wurden der Polymervorläufer und die Gelierlösung getrennt in zwei Spritzen überführt. Das Volumenverhältnis der Vorläuferlösung zur Gelierlösung betrug 24:1. Beide Lösungen wurden vor der Verwendung in den Spritzen entgast. TEMED wurde vor dem Mischen in einem Gewichtsverhältnis von 0,0028:1 (das Gewicht von TEMED zu Acrylamid) in die entgaste Vorläuferspritze gegeben. Die beiden Lösungen wurden schnell mit einem Spritzenanschluss gemischt und in eine Glasform gegossen. Das vernetzte Hydrogel wurde dann 24 Stunden lang in einen Gefrierschrank mit –20 °C überführt und dann mindestens 48 Stunden lang lyophilisiert, um Alginat-Xerogel zu bilden.

Um die adhäsive Funktionsflüssigkeit zu erhalten, wurden zunächst 2 % Chitosan in 0,14 M Essigsäure auf einen End-pH-Wert von 5 gelöst. Die Lösung wurde vor der Verwendung über Nacht gerührt. Anschließend wurden der Chitosanlösung EDC und NHS zu jeweils 20 mg/ml zugesetzt. Um die antibakterielle Funktionsflüssigkeit zu erhalten, wurden 5 % BZK in Wasser gelöst und über Nacht gerührt, um bei Raumtemperatur eine klare Lösung zu ergeben.

LIMB wurde durch Infusion einer funktionellen Flüssigkeit in ein Xerogel hergestellt. Konkret wurde die funktionelle Flüssigkeit zunächst bei Raumtemperatur auf eine Seite des Xerogels aufgetragen. Das Volumen der funktionellen Flüssigkeit wurde für einen bestimmten Volumenanteil des Xerogels genau gesteuert. Ein Applikator, beispielsweise eine Pipettenspitze, wurde verwendet, um die funktionelle Flüssigkeit gleichmäßig auf der Xerogeloberfläche zu verteilen. Die funktionelle Flüssigkeit wurde spontan und ohne Eingriff in das Xerogel aufgenommen. Nach 5–10 Minuten war LIMB gebrauchsfertig oder konnte zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank mit –80 °C überführt werden.

Insgesamt wurde zunächst 1 Gew.-% Chitosan hergestellt, indem Chitosan in 80 mM Essigsäure gelöst wurde. Die Lösung wurde vor der Verwendung durch 0,22-mm-PES-Filter sterilisiert. Ein gleiches Volumen wasserfreies Methanol wurde zur filtrierten Chitosanlösung gegeben und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde vor der Verwendung entgast. Rhodamin B und FITC wurden in wasserfreiem Methanol zu 2 mg mL-1 bzw. 1 mg mL-1 gelöst. Die Färbelösung wurde tropfenweise unter Rühren zur Chitosan/Methanol-Mischung gegeben. Die Endkonzentration der Fluoreszenzfarbstoffe im Reaktionsmedium wurde so gesteuert, dass die Markierung im Verhältnis 1:50 zum D-Glucosaminrest gegeben wurde. Die Reaktion dauerte 18 Stunden für Rhodamin B-markiertes Chitosan und 1 Stunde für FITC-markiertes Chitosan im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dann wurde eine NaOH-Lösung (1 mol/L) verwendet, um Chitosan aus der Lösung auszufällen. Die Niederschläge wurden gesammelt und 4 Tage lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert.

Die poröse Struktur der Proben wurde mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (F50, FEI) bei verschiedenen Vergrößerungen abgebildet. LIMBs wurden mit einem hochauflösenden Sputterbeschichter (ACE600, Leica) mit 4 nm Pt beschichtet, um ihre Oberflächenleitfähigkeit zu erhöhen. Die Porengröße wurde analysiert, indem für jeden Probentyp mindestens 20 Poren mit dem Messwerkzeug in ImageJ gemessen wurden. Die Porosität wurde berechnet, indem zunächst die SEM-Bilder in Binärbilder umgewandelt und die Anzahl der weißen Pixel durch die Anzahl der schwarzen Pixel dividiert wurde. Um Proben nach der Blutabsorption abzubilden, wurden die Proben zunächst mit einem überkritischen CO2-Punkttrockner (CPD030, Leica) dehydriert, um die ursprüngliche Morphologie vor der REM-Bildgebung zu bewahren.

Die Bruchzähigkeit von Hydrogelen wurde mithilfe reiner Schertests gemessen. Für jeden Test wurde ein Probenpaar (Breite 80 mm, Dicke 1,5 mm) auf starre Acrylklammern geklebt. Eine Probe war ungekerbt, die andere war kantengekerbt. Die Höhe (\(H\)) der Probe (dh der Abstand zwischen den beiden Acrylklammern) betrug 5 mm. Die ungekerbte Probe wurde von einer Instron-Maschine (Modell 5965) mit einer 1-kN-Lastzelle bei einer Dehnungsrate von 2 min−1 gezogen, um die Spannungs-Dehnungs-Kurve (\(S-\lambda\)) zu messen. Bei der gekerbten Probe wurde mit einer Rasierklinge eine Kerbe von ca. 30 mm Länge in eine Kante der Probe eingebracht. Die gekerbte Probe wurde bis zum Bruch gezogen, um eine kritische Dehnung zu erhalten (\({\lambda }_{{{{{{\rm{c}}}}}}}\)). Nach früheren Arbeiten48,49 wurde die Bruchenergie aus der \(S-\lambda\)-Kurve der ungekerbten Probe berechnet durch

Um das Zugverhalten unter zyklischer Belastung zu messen, wurden die Xerogele in Streifen mit einer Länge von 35 mm, einer Breite von 5 mm und einer Dicke von 1,5 mm geschnitten und mit einer Instron-Maschine (10 N-Kraftmessdose) getestet. Die Verdrängungsgeschwindigkeit betrug 100 mm min−1. Die nominale (technische) Spannung wurde durch Division der Kraft durch die anfängliche Querschnittsfläche ermittelt. Die nominale (technische) Dehnung wurde durch Division der Längenänderung durch die ursprüngliche Länge ermittelt.

Klebstoffe und Substrate wurden in Streifen mit einer Länge von 80 mm, einer Breite von 15 mm und einer Dicke von 1,5 mm geschnitten. Unter bestimmten Umständen wurden 150 μl Kaninchenvollblut gleichmäßig auf den Substraten verteilt. Die Klebstoffe wurden mit verschiedenen Substraten in Kontakt gebracht, 30 Minuten lang entweder bei Raumtemperatur oder bei 4 °C in einem verschlossenen Behälter inkubiert und anschließend mit Schältests unter Verwendung einer Instron-Maschine (10 N- oder 1 kN-Lastzelle) getestet. Vor dem Test wurden starre Polyethylenfolien (PET) (100 µm dick) mit Sekundenkleber (Krazy Glue) auf die Rückseite des Substrats bzw. der Klebstoffe geklebt. Bei 90°-Schältests betrug die Verschiebungsgeschwindigkeit 50 mm min−1. Die Adhäsionsenergie der Probe wurde berechnet, indem die durchschnittliche Kraft am Plateau (\({F}_{{{{{\rm{avg}}}}}}}\)) durch die Breite der Probe dividiert wurde:

Bei T-Peeling-Tests betrug die Verschiebungsrate 100 mm min−1. Die Adhäsionsenergie der Probe wurde berechnet, indem das Zweifache von \({F}_{{{{{\rm{avg}}}}}}}\) durch die Breite der Probe dividiert wurde:

Für Adhäsionstests an der menschlichen Aorta wurden die Proben von Transplant Québec nach Genehmigung durch die McGill-Ethikkommission bereitgestellt. Von zwei Organspendern wurden insgesamt 4 Proben der absteigenden Brustaorta entnommen. Ein Spender war ein 66-jähriger Mann mit einem Gewicht von 86 kg und einer Größe von 162 cm. Die Todesursache war ein Kopftrauma. Der Spender war gesund und hatte keine Krankheit. Der andere Spender war ein 47-jähriger Mann mit einem Gewicht von 92 kg und einer Größe von 188 cm. Die Todesursache war Schlaganfall.

Die Quellkinetik von LIMB, NB und trockenem NB (luftgetrocknet) wurde gemessen, indem die Proben auf die Oberfläche eines Wasserreservoirs gelegt wurden, wobei nur eine Oberfläche mit der Flüssigkeit in Kontakt kam. Die Kontaktzeit wurde bei Raumtemperatur zwischen 1 und 7200 s variiert. Die Wasseraufnahme pro Probengewicht wurde berechnet durch \(\frac{{m}_{1}-{m}_{0}}{{m}_{0}}\), wobei \({m}_{ 1}\) ist die gemessene Probenmasse nach der Absorption und \({m}_{0}\) die anfängliche Probenmasse.

Die Adhäsionskinetik von NB und 25 % hydratisiertem LIMB wurde mithilfe eines modifizierten Überlappungsscheraufbaus charakterisiert. Sowohl die Klebstoffe als auch die Kollagenhülle wurden zunächst auf einen starren PET-Träger geklebt. Anschließend wurde PBS auf einer ebenen Fläche gleichmäßig auf die Kollagenhülle aufgetragen, um eine Flüssigkeitssperrschicht zu bilden. An der Vorderseite des überlappenden Bereichs wurde ein anfänglicher Riss von 1 mm freigehalten, indem vor der Zugabe von PBS ein Stück dünner Parafilm auf dem Kollagen befestigt wurde. Die Dicke des PBS wurde durch das Volumen der Flüssigkeit gesteuert. Anschließend wurde der Kleber mit Träger ohne Druckausübung mit der mit der Flüssigkeitssperrschicht bedeckten Kollagenhülle in Kontakt gebracht. Der Überlappungsbereich (Breite × Länge) des Klebstoffs und der Kollagenhülle wurde auf 20 × 20 mm2 eingestellt. Zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt wurde der Überlappungsscherversuch durchgeführt, um die Kurven der Linienkraft \(F\) (Belastungskraft/Breite) und der Nenndehnung \(\varepsilon\) (Verschiebung/Länge) zu messen. Die Adhäsionsenergie wurde mit berechnet

wobei \({\varepsilon }_{{{\max }}}\) die Verschiebung ist, bei der \(F\) das Maximum erreicht hat.

Der Gerinnungszeittest wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll2,32,33,34 durchgeführt. Dieser Test basierte auf der Tatsache, dass Erythrozyten innerhalb eines Gerinnsels im Vergleich zu freien Erythrozyten aufgrund ihrer Formveränderungen während der Gerinnung bei hypertonen Bedingungen weniger zum Aufbrechen neigen50. LIMB und NB wurden beide in zylindrischen Formen mit einer Höhe von 5 mm und einem Durchmesser von 10 mm hergestellt. Ein Volumen von 50 μl rekalzifiziertem menschlichem Vollblut (8 μl 0,2 M CaCl2 pro 100 μl menschlichem Blut, gekauft von BioIVT) wurde der Probe in einem Zentrifugenröhrchen zugesetzt. Jede Probe reagierte 15, 30, 60, 90, 120 und 150 s lang mit Blut. Dann wurden 10 ml entionisiertes Wasser zugegeben, um die Reaktion zu stoppen und Hämoglobin aus freien Erythrozyten aufzulösen. Eine Negativkontrolle bestehend aus 50 µL rekalzifiziertem Vollblut in einem Zentrifugenröhrchen ergab einen Referenzwert. Der Hämoglobingehalt in der Lösung wurde anhand der Absorption des Überstands bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Synergy HTX, Agilent) gemessen. Für jede Bedingung wurden sechs Wiederholungen durchgeführt. Der Blutgerinnungsindex (BCI) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Dabei ist \({I}_{s}\) die Extinktion der Probe, \({I}_{r}\) die Extinktion des Referenzwerts (Negativkontrolle) und \({I}_{ 0}\) ist die Absorption von entionisiertem Wasser.

Die Zytotoxizität der LIMB-Matrix wurde unter Verwendung immortalisierter menschlicher Stimmlippenfibroblasten gemäß der International Organization for Standardization (ISO) 10993-5: Tests für In-vitro-Zytotoxizität bewertet. Für jeweils 200 mg LIMB-Matrix wurde 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) zur Extraktion hinzugefügt. Inzwischen wurden 20.000 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte ausgesät. Die Extrakte wurden nach einer 24-stündigen Inkubationszeit gesammelt und mit 1 % nicht-essentieller Aminosäure, 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum ergänzt. Das Kulturmedium in der 96-Well-Platte wurde dann durch die ergänzten LIMB-Matrixextrakte ersetzt. Als Kontrolle wurde fertiges, unberührtes DMEM verwendet. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang in einem Inkubator in einer Umgebung mit 37 °C, 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Atmosphäre kultiviert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines Live/Dead-Lebensfähigkeitskits (Invitrogen, L3224) gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet. Zur Untersuchung wurde konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (Zeiss, LSM710) eingesetzt. Lebende Zellen wurden in Grün und tote Zellen in Rot dargestellt.

Alle LIMB-Proben wurden in der gleichen Größe hergestellt und am Tag 0 gewogen. Danach wurde eine Enzymlösung bestehend aus 50 µg/ml Kollagenase (MP Biomedicals, 1951091), 50 µg/ml Lysozym (MP Biomedicals, 100831) und 0,01 % Den Gelen wurde Natriumazid (NaN3, Sigma, S2002) in PBS zugesetzt. Die Proben wurden bei 37 °C unter sanfter mechanischer Stimulation bei 75 U/min über 35 Tage inkubiert. Die Enzymlösung wurde jeden zweiten Tag gewechselt. In vorgegebenen Zeitintervallen wurde die Enzymlösung entfernt. Anschließend wurden die Proben dreimal (jeweils 5 Minuten) mit entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Proben lyophilisiert und das verbleibende Polymertrockengewicht gemessen. Der verbleibende Anteil des Polymers wurde berechnet, indem das verbleibende Polymertrockengewicht durch das anfängliche Trockengewicht der Gele dividiert wurde.

LIMBs wurden zunächst in Scheibenform (5 mm Durchmesser und 1,5 mm Höhe) präpariert und dann vollständig in PBS in einer verschlossenen Petrischale eingetaucht. Die Proben wurden bei 37 °C unter sanfter mechanischer Stimulation bei 75 U/min über 7 Tage inkubiert. Das Quellverhältnis wurde berechnet, indem der gemessene Durchmesser durch den Durchmesser der anfänglichen Gele im trockenen Zustand dividiert wurde.

LIMBs wurden zunächst durch Infusion unterschiedlicher Mengen adhäsiver funktioneller Flüssigkeit in Xerogele hergestellt und in einem versiegelten Beutel aufbewahrt. Die LIMBs wurden dann bei Raumtemperatur gelagert oder in einen Kühlschrank mit 4 °C oder einen Gefrierschrank mit –80 °C überführt, abhängig von den Testlagerbedingungen. Nach einer festgelegten Lagerzeit wurden die LIMBs aus dem Beutel genommen und auf Haftung getestet. Bei Lagerung bei –80 °C wurden die LIMBs vor der Verwendung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur im Beutel auftauen gelassen. Während der Probenvorbereitung für Schältests wurde keine Kompression angewendet.

Als Modellbakterienstämme wurden in dieser Studie das gramnegative Pseudomonas aeruginosa (PAO1) und das grampositive Bakterium Staphylococcus aureus (ATCC 25923) verwendet. Frische Bakterienkulturen wurden zunächst auf Nähragar aus Glycerinvorräten bei −80 °C hergestellt. Anschließend wurden Bakteriensuspensionen hergestellt, indem einzelne Kolonien von Agarplatten in Luria-Bertani-Brühe übertragen und die Medien bei 37 °C und 200 U/min inkubiert wurden. Sobald die Bakterien die exponentielle Wachstumsphase erreichten, wurden sie geerntet und bei 4000 × g zentrifugiert (Thermo Scientific, Heraeus Multifuge X3R). Nach dem Verwerfen des Überstands wurden die Zellen in PBS suspendiert. Die optische Dichte der Bakterien bei 600 nm (OD600) wurde mit einem UV-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Biomate 3S) auf 0,2 eingestellt. Die antimikrobielle Eigenschaft wurde durch 30-minütige Inkubation der Proben in 2 ml Bakteriensuspensionen in einer Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen bewertet. Getestet wurden makellose LIMB-Matrix und LIMB, infundiert mit 5 %iger BZK-Lösung in Wasser. Anschließend wurden die Proben vorsichtig mit frischem PBS gespült, um die lose anhaftenden Zellen zu entfernen. Die an den Proben haften gebliebenen Zellen wurden dann durch Zugabe von BacLight-Färbungen (Molecular Probes), die gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt wurden, auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Das BacLight-Kit enthält SYTO 9, das in Zellen mit intakten Membranen (lebende Zellen) eine fluoreszierende grüne Farbe (Anregung 483 nm/Emission 503 nm) erzeugt, und Propodeumiodid, das Zellen eine fluoreszierende rote Farbe (Anregung 535/Emission 617 nm) verleiht mit beeinträchtigten Membranen (tote/sterbende Zellen). Nach 15-minütiger Inkubation in Gegenwart von Farbstoffen wurden die Proben unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss, LSM710) beobachtet und für jedes Substrat an verschiedenen Orten mindestens 12 Bilder aufgenommen. Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Bakterien wurde berechnet, indem die Anzahl der lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen dividiert wurde.

Wir haben eine Berstkammer gemäß ASTM F2392 hergestellt: Standardtestmethode für die Berstfestigkeit von chirurgischen Dichtungsmitteln. Schweineherzgewebe wurde in Kreise (30 mm Durchmesser, ca. 2 mm Dicke) geschnitten. Anschließend wurde mit einer Biopsie-Stanze ein Loch mit 3 mm Durchmesser in der Mitte der kreisförmigen Gewebeprobe erzeugt. Xerogele wurden in Scheibenform (15 mm Durchmesser, 1,5 mm Dicke) hergestellt. Bei LIMBs mit Träger wurde ein kreisförmiger PET-Film (100 µm dick) mit Sekundenkleber auf eine Seite des Xerogels geklebt. Die adhäsive Funktionsflüssigkeit wurde zunächst in Xerogel (25 % hydratisiert) infundiert, um LIMB zu bilden. Um die Versiegelung einzuleiten, wurden LIMB und defektes Gewebe in Kontakt gebracht, um den defekten Bereich ohne Anwendung von Kompression vollständig abzudecken. Die Proben wurden vor dem Test über Nacht in einer feuchten Umgebung bei 4 °C aufbewahrt. Während des Tests wurde eine Spritze verwendet, um der Berstkammer Wasser zuzuführen und den Defekt zu erreichen. Zur Überwachung des hydraulischen Drucks wurde ein Manometer an den Zufuhrschlauch angeschlossen. Als Berstdruck wurde der Spitzendruck verwendet, der zum Austreten von Wasser oder zum Durchbrechen des Defekts führt.

Dieses Experiment wurde vom McGill University Animal Care Committee (Protokoll Nr. 2019-8098) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Die Stichprobengröße von Tierversuchen wird auf der Grundlage veröffentlichter Literatur zu ähnlichen Auswertungen ausgewählt8,22,33. Für alle In-vivo-Rattenstudien wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g, Charles River Laboratories) verwendet. Vor der Implantation wurden sowohl NBs als auch LIMBs (zu 25 % mit der adhäsiven Funktionsflüssigkeit hydratisiert) unter Verwendung aseptischer Techniken in Scheibenform präpariert. Die Größe hatte einen Durchmesser von 5 mm und eine Dicke von 2 mm. Zur Implantation im dorsalen subkutanen Raum wurden Ratten in einer Induktionskammer mit Isofluran (4 % Isofluran in Sauerstoff) anästhesiert. Die Anästhesie wurde während der Operation mit einem Nasenkegel bei 2 % Isofluran aufrechterhalten. Ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung wurde subkutan injiziert. Die Haare wurden entfernt und die Ratten wurden während der Operation auf ein Heizkissen gelegt. Der Zugang zum subkutanen Raum erfolgte durch einen 1 cm langen Hautschnitt pro Implantat im Rücken der Ratte. Vom Einschnittpunkt in Richtung der Schulterblätter der Ratte wurde eine stumpfe Dissektion durchgeführt, um subkutanen Raum für die Implantation zu schaffen. NBs und LIMBs wurden in die subkutanen Räume implantiert. Pro Ratte wurden bis zu vier Implantate eingesetzt. Die Hautschnitte wurden mit Nähten verschlossen. Am 3., 7. und 28. Tag wurden die Ratten durch 5 % Isofluran-Induktion und anschließende CO2-Inhalation eingeschläfert. Subkutane Regionen von Interesse wurden herausgeschnitten und zur histologischen Analyse 48 Stunden lang in 4% Paraformaldehydlösung fixiert.

Für den biologischen Abbau in vivo wurden FITC-markierte LIMBs zur Bildgebung der Bioverteilung verwendet. Während der Probenentnahme für das Biokompatibilitätsexperiment wurden gleichzeitig wichtige Organe (Leber, Niere, Lunge, Herz und Milz) von Ratten entnommen und mit einem IVIS-Spektrofluorphotometer abgebildet, um den Clearance-Weg darzustellen.

Dieses Experiment wurde vom McGill University Animal Care Committee (Protokoll Nr. 2019-8098) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Zur hämostatischen Abdichtung der volumetrischen Leberschädigung wurden die Ratten mit Isofluran (4 % Isofluran in Sauerstoff) in einer Induktionskammer anästhesiert. Die Anästhesie wurde während der Operation mit einem Nasenkegel bei 2 % Isofluran aufrechterhalten. Ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung wurde subkutan injiziert. Die Bauchhaare wurden entfernt und die Ratten wurden für die Dauer der Operation auf ein Heizkissen gelegt. Die Leber wurde durch eine Laparotomie freigelegt. Mithilfe einer Biopsiestanze wurde eine volumetrische Verletzung der Leber mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Tiefe von 3 mm vorgenommen. Zylindrisch geformter SURGIFOAM (Ethicon) oder LIMB mit 5 mm Durchmesser und 4 mm Tiefe wurde sofort in die Wunde eingeführt. Für jede Gruppe wurde das Ausmaß des Blutverlusts bis zum Erreichen der Blutstillung und die Zeit bis zur Blutstillung aufgezeichnet. Nachdem die hämostatische Abdichtung bestätigt war, wurde der Einschnitt mit Nähten verschlossen. Zwei Wochen nach der Implantation wurden die Ratten durch 5 % Isofluran-Induktion und anschließende CO2-Inhalation eingeschläfert. Lebern mit den Implantaten wurden herausgeschnitten und zur histologischen Analyse 48 Stunden lang in 4%iger Paraformaldehydlösung fixiert.

Dieses Experiment wurde vom McGill University Animal Care Committee (Protokoll Nr. 2019-8098) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Zur hämostatischen Abdichtung der tiefen Leberinzisionsverletzung wurden die Ratten mit Isofluran (4 % Isofluran in Sauerstoff) in einer Induktionskammer anästhesiert. Die Anästhesie wurde während der Operation mit einem Nasenkegel bei 2 % Isofluran aufrechterhalten. Ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung wurde subkutan injiziert. Die Bauchhaare wurden entfernt und die Ratten wurden für die Dauer der Operation auf ein Heizkissen gelegt. Die Leber wurde durch eine Laparotomie freigelegt. Mit einem Skalpell Nr. 11 wurde eine Risswunde von 7 mm Länge und 3 mm Tiefe in die Leber eingebracht. Unmittelbar nach dem Abwischen des Blutes mit Gaze wurde ein vorher abgewogenes LIMB-, NB- oder handelsübliches blutstillendes Mittel auf die Läsionsstelle aufgetragen. Der Hämostat wurde unter bestimmten Bedingungen von Hand an Ort und Stelle gehalten, ohne Druck auf die Wunde auszuüben. Für jede Gruppe wurde das Ausmaß des Blutverlusts bis zum Erreichen der Blutstillung und die Zeit bis zur Blutstillung aufgezeichnet. Die Blutungszeit von LIMB wurde erst nach 2 Minuten und nicht vorher überprüft. Nach der Operation wurden die Ratten durch 5 % Isofluran-Induktion und anschließende CO2-Inhalation eingeschläfert.

Dieses Experiment wurde vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt (Protokoll Nr. A18–0348) und gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Alle Eingriffe wurden mit den Tieren unter Vollnarkose durchgeführt. Weibliche Schweine (3 Monate alt, 40–50 kg) wurden mit 4 % Isofluran induziert, endotracheal intubiert und mechanisch mit 10–12 Atemzügen/Minute beatmet. Die Anästhesie wurde mit 1–3 % Isofluran in Kombination mit Propofol (2–7 mg/kg/h) und Midazolam (0,4–0,7 mg/kg/h) aufrechterhalten. Zur Medikamenten- und Flüssigkeitsverabreichung wurden lange zentrale IV-Katheter in beide Ohren gelegt. Zur invasiven Blutdruckmessung wurde ein intraarterieller Katheter in beide Fußarterien des Hinterbeins eingeführt. Diese Katheter wurden mit Klebeband befestigt und an Ort und Stelle verbunden, um die Blutentnahme während der gesamten Erholungsphase zu ermöglichen. Die Temperatur wurde mit einem Heizkissen auf 38,5–39,5 °C gehalten und mit einem rektalen Temperaturfühler überwacht. Die Flüssigkeitszufuhr wurde mit 1,25 % Dextrose in Isolytlösung aufrechterhalten, die intravenös mit 3–5 ml/kg/h verabreicht wurde.

Während das Tier in Rückenlage lag, wurde eine Laparotomie durchgeführt. Mit einem Skalpell wurden Leberrisse von 1,5 cm Länge und 1 cm Tiefe erzeugt. Einfache Gaze oder LIMB wurde ohne zusätzliche manuelle Kompression vorsichtig auf die Verletzungsstelle aufgetragen. Der Blutverlust wurde quantifiziert, indem zuvor abgewogene Gaze in die Bauchhöhle gegeben und die Massenänderung der Gaze gemessen wurde. Die Zeit bis zur Blutstillung wurde gemessen. Der Überwachungszeitraum dauerte 10 Minuten. Anschließend wurde die Blutung durch manuelle Kompression endgültig gestoppt, sodass dem Schwein weitere Verletzungen zugefügt werden konnten. Wir haben versucht, die Anzahl der Verletzungen bei jedem Schwein auf drei zu maximieren oder bis die invasive Blutdruckmessung an den Fußarterien der Hinterbeine unter den normalen Bereich fiel, je nachdem, was zuerst eintrat.

Fixierte Gewebeproben wurden in 70 %iges Ethanol gegeben und zur histologischen Verarbeitung und H&E-Färbung am Histology Core der McGill University eingereicht. Z.-HG ist der leitende Pathologe der University of British Columbia und untersuchte alle histologischen Schnitte. Repräsentative Bilder jeder Gruppe wurden in den entsprechenden Abbildungen gezeigt.

Für alle Experimente wurde eine Stichprobengröße von N ≥ 3 verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA und Post-hoc-Tukey-Tests für mehrere Vergleiche oder Student-t-Tests für den Vergleich zwischen zwei Gruppen (Prisma 9) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Zusätzliche Rohdatensätze, die während der Studie generiert wurden, sind zu umfangreich, um öffentlich geteilt zu werden. Sie sind jedoch auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom New Frontiers in Research Fund – Exploration (Grant NFRFE-2018-00751, JL und CK), den Canadian Institutes of Health Research (Grant PJT-180232, JL) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada unterstützt (Stipendium RGPIN-2018-04146, JL) und das National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (Stipendien R01-DC018577, LM; R01-DC005788, LM; und R01-DC014461, LM). Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder. Die Autoren danken Transplant Québec, das die menschlichen Aorten nach Genehmigung durch die McGill-Ethikkommission bereitgestellt hat. Die Autoren danken außerdem Dr. Susan Thibeault (University of Wisconsin-Madison) für die Bereitstellung der hVFFs, Dr. Nathalie Tufenkji (McGill University) für die Bakterienkultur, Lih Jiin Juang (University of British Columbia) für ihre Hilfe bei Tierstudien und Li Li (McGill University) für Unterstützung in der Mikroskopie und der Advanced BioImaging Facility (ABIF, McGill University) für die Bereitstellung des Zugangs zu ihren Bildgebungseinrichtungen.

Fakultät für Maschinenbau, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Guangyu Bao, Qiman Gao, Mitchell Strong, Shuaibing Jiang, Zhen Yang, Zhenwei Ma, Marco Amabili, Luc Mongeau und Jianyu Li

Fakultät für Zahnmedizin, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Qiman Gao

Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

Massimo Cau, Nabil Ali-Mohammed und Christian Kastrup

Fakultät für Chemieingenieurwesen, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Amin Valiei

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

Zu-Hua Gao

Blutforschungsinstitut, Versiti, Milwaukee, WI, USA

Christian Kastrup

Abteilung für Chirurgie, Abteilung für Unfall- und Akutchirurgie, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Christian Kastrup

Abteilung für Biochemie, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Christian Kastrup

Abteilung für Biomedizintechnik, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Christian Kastrup

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Christian Kastrup

Abteilung für Biomedizintechnik, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Jianyu Li

Abteilung für Chirurgie, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Jianyu Li

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JL und GB hatten die Idee und gestalteten die Studie. GB, MS, SJ und AV führten die In-vitro-Experimente durch. QG, GB, MC und NA führten die In-vivo-Studien durch. ZM, MA und CK halfen mit Ressourcen und Experimenten. GB, ZY, SJ, ZH.G., LM, CK und JL analysierten und interpretierten die Ergebnisse. GB und JL haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Christian Kastrup oder Jianyu Li.

Die McGill University hat einen Patentschutz für die hier beschriebenen Materialien und Methoden angemeldet, und GB, JL, LM, QG und MS werden als Erfinder des Patents genannt. CK, MC und NA sind über CoMotion Drug Delivery Systems, Inc. an Kommerzialisierungsaktivitäten im Zusammenhang mit hämostatischen Produkten beteiligt. Die übrigen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

Nature Communications dankt Xuehong Ren und den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bao, G., Gao, Q., Cau, M. et al. Mit Flüssigkeit infundierte mikrostrukturierte Bioadhäsive stoppen nicht komprimierbare Blutungen. Nat Commun 13, 5035 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32803-1

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Eingegangen: 07. Januar 2022

Angenommen: 17. August 2022

Veröffentlicht: 26. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32803-1

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